Title
Analiza ekspresije, aktivnosti i lokalizacije FeAPL1- novog tipa asparatične proteinaze heljde -Fagopyrum esculentum Moench-
Creator
Milisavljević, Mira.
Copyright date
2009
Object Links
Select license
Autorstvo-Nekomercijalno-Bez prerade 3.0 Srbija (CC BY-NC-ND 3.0)
License description
Dozvoljavate samo preuzimanje i distribuciju dela, ako/dok se pravilno naznačava ime autora, bez ikakvih promena dela i bez prava komercijalnog korišćenja dela. Ova licenca je najstroža CC licenca. Osnovni opis Licence: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/rs/deed.sr_LATN. Sadržaj ugovora u celini: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/rs/legalcode.sr-Latn
Language
Serbian
Cobiss-ID
Theses Type
Doktorska disertacija
description
Datum odbrane: 4.12.2009.
Other responsibilities
mentor
Maksimović, Vesna R.
član komisije
Radović, Svetlana, 1958-
član komisije
Fira, Đorđe, 1959-
Academic Expertise
Prirodno-matematičke nauke
Academic Title
-
University
Univerzitet u Beogradu
Faculty
Biološki fakultet
Alternative title
Analyses of expression, activity and localization of the new type of aspartic proteinase (FeAPL1) from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)
Publisher
[M. Milisavljević]
Format
101 list
description
Mолекуларна биологија / Molecular biology
Abstract (sr)
Iz biblioteke cDNK semena heljde u srednjoj fazi sazrevanja prethodno je izolovana cDNK koja kodira atipičnu aspartičnu proteinazu (FeAPL1), a zatim i odgovarajući genomski fragment koji, osim kodirajuće sekvence, sadrži i 5’-regulatorni region u kome su uočeni cis-elementi koji mogu učestvovati u regulaciji ekspresije ovog gena pod uticajem faktora spoljašnje sredine i opredeljivati njegovu seme-specifičnu ekspresiju.
U ovom radu uradjena je detaljna analiza ekspresije gena FeAPL1 po organima heljde- na nivou RNK upotrebom metoda RT-PCR i Real Time RT-PCR, a analizom Western blot na nivou proteina. Umnošci slabog intenziteta su uočeni u fazama sazrevanja semena do stadijuma 14 DAF, za kojima sledi naglo povećanje količine transkripta u stadijumu 14-17 DAF, nakon čega dolazi do smanjenja količine RNK. Profil ekspresije proteina prati profil ekspresije RNK. U listu, korenu, stablu i cvetu uočene su male količine transkripta, ali odgovarajući protein nije bio prisutan.
Kako je kompjuterskom analizom predikovano više cis-aktivirajućih elemenata u promotorskom regionu gena za FeAPL1, njegova ekspresija je praćena i pod uticajem stresogenih faktora spoljašnje sredine (UV zračenje, mrak, mehanička povreda, suša, salicilna kiselina), ali značajne promene u ekspresiji nisu oučene ni u jednom ispitivanom slučaju.
U cilju dobijanja proteina u količini pogodnoj za biohemijsku analizu i produkciju antitela, korišćeno je nekoliko ekspresionih sistema: E. coli, P. pastoris i kultura insekatskih ćelija. Zadovoljavajuća ekspresija dobijena je jedino pri upotrebi konstrukta rMBP-FeAPL1 u soju Rosetta-gami E. coli u kome je dobijen solubilan rekombinantni fuzioni proteina koji, nakon proteolitičke obrade, poseduje enzimsku aktivnost na pH 3,0, inhibiranu pepstatinom A.
Rekombinantni protein, rFeAPL1-His6, od ~55 kDa, je eksprimiran u ćelijskoj liniji duvana BY-2 u kome je detektovana pepstatin A senzitivna enzimska aktivnost na pH 3,0 bez prethodne proteolitičke obrade. Veća molekulska masa u odnosu na predikovanu (46 kDa) ukazuje na verovatnu glikozilaciju proteina. Imunocitohemijskom analizom i analizom proteina protoplasta transformisanih BY-2 ćelija je utvrđeno da je FeAPL1 lokalizovan u ćelijskom zidu. Na osnovu dobijenih rezultata diskutovane su potencijalne funkcije proteinaze FeAPL1.
Type
Tekst
Abstract (sr)
Iz biblioteke cDNK semena heljde u srednjoj fazi sazrevanja prethodno je izolovana cDNK koja kodira atipičnu aspartičnu proteinazu (FeAPL1), a zatim i odgovarajući genomski fragment koji, osim kodirajuće sekvence, sadrži i 5’-regulatorni region u kome su uočeni cis-elementi koji mogu učestvovati u regulaciji ekspresije ovog gena pod uticajem faktora spoljašnje sredine i opredeljivati njegovu seme-specifičnu ekspresiju.
U ovom radu uradjena je detaljna analiza ekspresije gena FeAPL1 po organima heljde- na nivou RNK upotrebom metoda RT-PCR i Real Time RT-PCR, a analizom Western blot na nivou proteina. Umnošci slabog intenziteta su uočeni u fazama sazrevanja semena do stadijuma 14 DAF, za kojima sledi naglo povećanje količine transkripta u stadijumu 14-17 DAF, nakon čega dolazi do smanjenja količine RNK. Profil ekspresije proteina prati profil ekspresije RNK. U listu, korenu, stablu i cvetu uočene su male količine transkripta, ali odgovarajući protein nije bio prisutan.
Kako je kompjuterskom analizom predikovano više cis-aktivirajućih elemenata u promotorskom regionu gena za FeAPL1, njegova ekspresija je praćena i pod uticajem stresogenih faktora spoljašnje sredine (UV zračenje, mrak, mehanička povreda, suša, salicilna kiselina), ali značajne promene u ekspresiji nisu oučene ni u jednom ispitivanom slučaju.
U cilju dobijanja proteina u količini pogodnoj za biohemijsku analizu i produkciju antitela, korišćeno je nekoliko ekspresionih sistema: E. coli, P. pastoris i kultura insekatskih ćelija. Zadovoljavajuća ekspresija dobijena je jedino pri upotrebi konstrukta rMBP-FeAPL1 u soju Rosetta-gami E. coli u kome je dobijen solubilan rekombinantni fuzioni proteina koji, nakon proteolitičke obrade, poseduje enzimsku aktivnost na pH 3,0, inhibiranu pepstatinom A.
Rekombinantni protein, rFeAPL1-His6, od ~55 kDa, je eksprimiran u ćelijskoj liniji duvana BY-2 u kome je detektovana pepstatin A senzitivna enzimska aktivnost na pH 3,0 bez prethodne proteolitičke obrade. Veća molekulska masa u odnosu na predikovanu (46 kDa) ukazuje na verovatnu glikozilaciju proteina. Imunocitohemijskom analizom i analizom proteina protoplasta transformisanih BY-2 ćelija je utvrđeno da je FeAPL1 lokalizovan u ćelijskom zidu. Na osnovu dobijenih rezultata diskutovane su potencijalne funkcije proteinaze FeAPL1.
“Data exchange” service offers individual users metadata transfer in several different formats. Citation formats are offered for transfers in texts as for the transfer into internet pages. Citation formats include permanent links that guarantee access to cited sources. For use are commonly structured metadata schemes : Dublin Core xml and ETUB-MS xml, local adaptation of international ETD-MS scheme intended for use in academic documents.