Application of novel recombinant pectinolytic enzymes in improving the fruit juices characteristics

[М. Павловић]

91 стр.

Хемија - Биохемија / Chemistry - Biochemistry

Ова докторска дисертација се бави изолoвањем, карактеризацијом, рекомбинантном производњом и оптимизацијом синтезе пектинолитичких ензима у циљу њихове примене у индустрији воћних сокова, ради побољшања њихове текстуре, бистрине и квалитета. Истраживање обухвата развој нових стратегија за оптимизацију производње пектинолитичких ензима и коришћење савремених биотехнолошких метода, као што су хетерологна експресија у микроорганизмима, ради постизања економичније и ефикасније производње. Полигалактуроназе (ПГ) су међу најзначајнијим пектинолитичким ензимима и играју кључну улогу у деполимеризацији пектина. Ови ензими хидролизују α-1,4-гликозидне везе у молекулима полигалактуронске киселине, што резултује ослобађањем растворљивих галактуронских фрагмената. У дисертацији је посебно анализирана биохемијска карактеризација ПГ, укључујући одређивање њихове оптималне температуре, pH, молекулске масе и изоелектричне тачке. Показано је да ПГ имају критичну улогу у смањењу вискозности воћних сокова и унапређењу процеса отечњавања, што је од суштинске важности за повећање приноса и добијање бистрог и стабилног производа. Пектин лијазе су друга важна група пектинолитичких ензима која катализује нехидролитичку разградњу пектина путем β-елиминације, ослобађајући незасићене галактуронске фрагменте. За разлику од хидролазних ензима, пектин лијазе не производе метанол током реакције, што их чини посебно погодним за примену у преради воћних сокова и вина, где је важно избећи повећање концентрације метанола. У дисертацији су тестиране пектин лијазе из различитих бактеријских изолата, посебно рода Bacillus, и утврђено је да имају изузетну активност и стабилност при различитим pH и температурама. Ови ензими су значајни за уклањање замућености и побољшање транспарентности воћних сокова, као и за производњу безбедних и квалитетних напитака. Клонирање гена за пектинолитичке ензиме у Escherichia coli је важан аспект истраживања. E. coli је широко коришћен систем за експресију због своје једноставности рада, великог броја експресионих вектора, брзог раста и високе продуктивности. У овом раду, гени који кодирају пектин хидролазе и пектин лијазе су изоловани из Bacillus velezensis 16B и Aspergillus tubingensis FAT 43, а затим клонирани у векторе pMALc5HisEk и pQE_Ek за експресију у E. coli. Производња ензима у овом систему омогућила је високе приносе, брзо добијање протеина и економичну производњу. Посебно је важно нагласити да ови експресиони вектори обезбеђују лако пречишћавање рекомбинантних ензима, јер протеинима додају 6His-ознаке за афинитетну хроматографију везивања за метал. Квасац Pichia pastoris је коришћен као модел еукариотског система за експресију пектинолитичких ензима, са посебним фокусом на посттранслационе модификације које су од суштинске важности за стабилност и активност ензима. У овом систему је клониран ген за ендо-полигалактуроназу из A. tubingensis FAT 43, при чему је експресија индукована метанолом. Овај систем се показао веома погодним за производњу ензима еукариотског порекла. У експериментима ове дисертације је показано да интеграција пектинолитичких ензима у индустријске процесе може побољшати квалитет и количину произведених воћних сокова, уз истовремено смањење трошкова и повећање ефикасности. Примена савремених техника клонирања и хетерологне експресије у E. coli и P. pastoris обезбедила је производњу пречишћених ензима са побољшаним својствима, што доприноси њиховој широкој примени у прехрамбеној и другим индустријама.

This doctoral dissertation focuses on isolation, characterization, recombinant production and optimization of the synthesis of pectinolytic enzymes for their application in the fruit juice industry to improve the texture, clarity, and quality of fruit juices. The research includes the development of new strategies for optimizing the production of pectinolytic enzymes and the use of modern biotechnological methods, such as heterologous expression in microorganisms, to achieve more economical and efficient production. Polygalacturonases (PG) are among the most significant pectinolytic enzymes, playing a crucial role in pectin depolymerization. These enzymes hydrolyze α-1,4-glycosidic bonds in polygalacturonic acid molecules, resulting in the release of soluble galacturonic fragments. The dissertation specifically analyzed the biochemical characterization of PG, including the determination of its optimal temperature, pH, molecular weight, and isoelectric point. It was demonstrated that PG enzymes play a critical role in reducing the viscosity of fruit juices and enhancing the liquefaction process, which is essential for increasing yield and producing clear and stable products. Pectin lyases represent another important group of pectinolytic enzymes that catalyze the non-hydrolytic degradation of pectin via β-elimination, releasing unsaturated galacturonic fragments. Unlike hydrolase enzymes, pectin lyases do not produce methanol during the reaction, making them particularly suitable for use in fruit juice and wine processing, where it is crucial to avoid increasing methanol concentrations. In the dissertation, pectin lyases from various bacterial isolates, particularly from the genus Bacillus, were tested, and it was found that they exhibit exceptional activity and stability under different pH and temperature conditions. These enzymes are significant for removing turbidity, enhancing fruit juice transparency, and producing safe and high-quality beverages. Cloning of genes encoding pectinolytic enzymes in Escherichia coli was an important aspect of the research. E. coli is widely used as an expression system due to its simplicity for manipulation, large number of expression vectors, rapid growth, and high productivity. In this work, genes encoding pectin hydrolases and pectin lyases were isolated from Bacillus velezensis 16B and Aspergillus tubingensis FAT 43, and then cloned into the vectors pMALc5HisEk and pQE_Ek for expression in E. coli. Enzyme production in this system allowed high yields, rapid protein production, and cost-effective manufacturing. It is particularly important to emphasize that these expression vectors provide easy purification of recombinant enzymes because they add 6His-tags to the proteins for metal-binding affinity chromatography. The yeast Pichia pastoris was used as a model eukaryotic system for the expression of pectinolytic enzymes, with a special focus on post-translational modifications essential for enzyme stability and activity. In this system, the gene encoding endo-polygalacturonase from A. tubingensis FAT 43 was cloned, and its expression was induced by the addition of methanol. This system proved highly suitable for producing enzymes of eukaryotic origin. In the experiments of this dissertation, it was demonstrated that the integration of pectinolytic enzymes into industrial processes significantly improves fruit juice yield and quality, while simultaneously reducing costs and increasing efficiency. The application of modern cloning techniques and heterologous expression in E. coli and P. pastoris has ensured the production of purified enzymes with enhanced properties, contributing to their widespread use/application in the food and other industries.

пектинолитички ензими, ендо-полигалактуроназа, пектин лијаза, оптимизација, прерада воћних сокова, рекомбинантна производња ензима

pectinolytic enzymes, endo-polygalacturonase, pectin lyase, optimization, fruit juice processing, recombinant enzyme production

547.458.88:577.15(043.3)

Tekst