The interaction of genetic markers of proliferation, differentiation and apoptosis in acute leukemias

Leukemije predstavljaju klonalne maligne bolesti hematopoetskog tkiva, koje nastaju kao posledica poremećaja u procesima proliferacije, diferencijacije i/ili apoptoze. Leukemogeneza je višestepeni proces u kome postepeno dolazi do akumulacije genetičkih i epigenetičkih promena koje na kraju dovode do ekspresije kompletnog leukemijskog fenotipa. Cilj ovog istraživanja bio je praćenje genetičkih markera proliferacije diferencijacije i apoptoze kod obolelih od akutne mijeloidne leukemije (AML) i akutne limfoblastne leukemije (ALL), kao i sagledavanje njihovih medusobnih interakcija. Istraživanja su obuhvatila; 1) utvrđivanje učestalosti mutacija u genu za FLT3 i NPM1, ispitivanje uticaja koje njihovo prisustvo ima na prognozu i preživljavanje obolelih, kao i ispitivanje njihove medusobne povezanosti u procesima leukemogeneze, 2) analizu ekspresije gena vezanih za procese apoptoze i proliferacije, i to; ekspresije FLT3 gena koji ima značajnu ulogu u procesima proliferacije, ekspresije gena za FAS i FAS-L kao osnovnih činilaca spoljašnjeg puta aktivacije apoptoze, i ekspresije gena BCL2 familije kao osnovnih činilaca unutrašnjeg puta aktivacije apoptoze. Ispitivanjem zastupljenosti FLT3 mutacija kod obolelih od adultne i pedijatrijske AML je pokazano da su bile prisutne u 25%, odnosno u 9,5% slučajeva. Pokazano je da FLT3+ pacijenti imaju značajno nižu stopu postizanja kompletne remisije, čime je potvrdeno da prisustvo FLT3 mutacija pretstavlja nepovoljan faktor prognoze bolesti. Dužina FLT3/ITD duplikacije kao i veličina odnosa ITD/wt nisu povezani sa određenom kliničkim karakteristilkama, niti imaju bilo kakvog uticaja na prognozu i ishod bolesti. Ispitivanjem ekspresije FLT3 gena kod adultinih AML i pedijatrijskih ALL pacijenata pokazana je značajna povezanost visokog nivoa ekspresije FLT3 sa nepovoljnom prognozom. Praćenjem nivoa ekspresije FLT3 gena u različitim vremenskim periodima u toku trajanja bolesti, pokazano je da FLT3 ekspresija pretstavlja potencijalni marker za praćenje minimalne rezidualne bolesti. Ispitivanjem zastupljenosti NPM1 mutacija kod obolelih od adultne AML je pokazano da su bile prisutne u 18,5% slučajeva, dok je kod pedijatrijskih AML bolesnika, učestalost ovih mutacija iznosila 2,7%. Detektovane NPM1 mutacije kod adultnih pacijenata su najčešće bile A tipa (88,2%), dok je kod pedijatrijskih pacijenata, detektovana retka mutacija mutacija Q tipa. Postojanje očigledne razlike u frekvenciji i u tipu NPM1 mutacija izmedu adultne i pedijatrijske AML, govori u prilog pretpostavci o postojanju različite biologije i etiologije AML kod ove dve grupe pacijenata. U našoj grupi pacijenata prosustvo NPM1 mutacije je pretstavljalo nepovoljan prognostic^ faktor. Pokazano je da je prisustvo NPM1 mutacija značajno povezano sa normalnim kariotipom i prisustvom FLT3 mutacija. Praćenjem ekspresije gena za FAS i FAS-L kod obolelih od AML i pedijatrijske ALL, primećena je izrazita heterogenost, bez uticaja na prognozu i ishod bolesti. Istovremena heterogenost rezultata dobijenih ispitivanjem veličine odnosa mFAS/sFAS transkripta, doprinose zaključku da poremećaj FAS-indukovane apoptoze nije esencijalan za proces leukemogeneze. Praćenje ekspresije gena BCL2 familije, uočena je značajna veza između povećane ekspresije anti- apoptotskog BCL2 gena i smrtnog ishoda bolesti, kao i značajna korelacija izmedu smanjene ekspresije pro-apoptotskog BAX gena i povoljne prognoze. Rezultati dobijeni odredivanjem vrednosti odnosa ekspresije BCL2/BAX su doprineli zaključku da, iako pojedinačno BCL2 i BAX pretstavljaju snažne supresore, odnosno aktivatore procesa apoptoze, oni predstavljaju samo jedan od brojnih faktora koji određuju krajnju sudbinu leukemijske ćelije. Praćenje ekspresije BCL2L12 gena je pokazalo da povećana ekspresija BCL2L12 gena predstavlja nezavisan nepovoljan faktor prognoze i ishoda bolesti. Iz svega navedenog možemo da zaključimo da su akutne leukemije veoma heterogena oboljenja, kao i da se ova heterogenost zasniva na različitim kombinacijama genetičkih promena koje se dešavaju na molekularnom nivou. Naša istraživanja usmerena u pravcu izučavanja načina na koji pojedine genetičke promene remete osnovne ćelijske procese, kao i njihovog sinergističkog delovanja u procesima leukemogeneze, doprinela su boljem razumevanju molekularne osnove leukemija. Takođe, naši rezultati ukazuju na neophodnost detekcije novih markera bolesti koji će poslužiti kao osnova za dizajn novih specifičnih terapeutika i efikasnijih protokola lečenja, a sve za dobrobit pacijenta.

Leukemias represent clonal neoplastic hematopoietic disorders that emerge as a consequence of deregulation in the process of differentiation, proliferation and apoptosis. Leukemogenesis is a multistep process involving acquisition of series of genetic and epigenetic alterations leadingto the development of the full blown leukemia. In this study we investigated the genetic markers of the proliferation, differentiation and apoptosis and their mutual interactions in the acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoid leukemia (ALL) patients. This study has included detection of the FLT3 and NPM1 gene mutations, the most frequent mutations in the adult AML patients, and the effects that they have on the prognosis and outcome of the disease, and also their cooperation in the leukemogenic process. We also analyzed the expression pattern of the gene involved in proliferation and apoptotic processes, such as; the expression of the FLT3 gene involved in the proliferation, expression of the FAS and FAS-L gene involved in the external apoptotic pathway, and expression of the BCL2 family genes, involved in the internal apoptotic pathway. The frequency of the FLT3 mutations among the adult and pediatric AML patients was 25% and 9,5%, respectively. It was confirmed that the FLT3 mutations represent an adverse prognostic factor, because FLT3+ patients had lower complete remission rate. The size of the FLT3/ITD duplication and the ITD/wt ratio were not associated with the particular clinical characteristics and had no impact on the prognosis and the outcome of the disease. Investigation of the FLT3 expression levels in adult AML and pediatric ALL patients showed significant correlation between high FLT3 expression level and poor prognosis. Follow-up of the FLT3 expression level during the course of the disease showed that FLT3 expression monitoring had a great value as a potential marker of minimal residual disease. The frequency of the NPM1 mutations among the adult and pediatric AML patients was 18,5% and 2,7%, respectively. NPM1 mutations detected among adults were mostly of type A (88,2%), whereas among pediatric patients we detected type Q mutation. Evident differences that exist between adult and pediatric AML patients, regarding the frequency and the type of the NPM1 mutations, contribute to the hypothesis of different biology and etiology of AML among these two groups. In our cohort of patients the presence of the NPM1 mutation had an adverse impact on the prognosis. Also, it was shown that the presence of the NPM1 mutations was associated with normal karyotype and the presence of the FLT3 mutations. We detected extreme heterogeneity in the expression pattern of the FAS and FAS-L gene, both in the AML and ALL patients, without having any impact on the prognosis and the outcome of the disease. Alongside with the heterogeneity of the mFAS/sFAS transcript ratio, we concluded that the disruption of the FAS-induced apoptosis is not essential for the leukemogenic process. The investigation of the expression levels of the genes from the BCL2 family showed association between high expression level of BCL2 and deadly outcome, as well as association between low BAX expression level and good prognosis. In addition, the values of the calculated BCL2/BAX ratio additionally supported the conclusion that, although individually BCL2 and BAX represent strong apoptotic suppressors and activators, they represent only a part of the numerous factors that determine the ultimate fate of the leukemic cell. The investigation of the expression level of the BCL2L12 gene in the adult AML patients showed that patients that express high level of BCL2L12 are more likely to relapse or die, in other words BCL2L12 can be characterized as a new independent prognostic marker in AML. On the bases on everything stated, we can conclude that acute leukemias are very heterogeneous diseases at the molecular level, as each is driven by some combination of different genetic alterations. Our research focused on investigation of genetic markers altering basic cell processes, as well as their synergistic behavior in the leukemogenic process, contributed to the better understanding of the molecular basis of the disease. Also, our findings emphasize the need for the detection of the new disease markers, which will serve as the basis for the design of new specific therapeutics and new efficient treatment protocols, all for the benefit of the patients.