Intensification of the continuous prebiotic oligosaccharide production process

[R. N. Pravilović]

137 str.

Tehnološko inženjerstvo - Hemijsko inženjerstvo / Technological Engineering -: Chemical Engineering

Predmet ove teze je intenzifikacija procesa proizvodnje prebiotika i u radu je dokazano da se enzimska sinteza prebiotskih oligosaharida može prevesti sa šaržnog na kontinualni proces, uz povećanje produktivnosti. U radu je predložen novi mehanistički kinetički model za sintezu galakto-oligosaharida (GOS) sa β-galaktozidazom iz Aspergillus orizae. Eksperimenti su izvedeni u šaržnom laboratorijskom sistemu. Ispitano je nekoliko kinetičkih modela sa različitim reakcionim mehanizmima, koji pokrivaju širok opseg početnih koncentracija laktoze (200-400 g/l) i enzima (0,5-2 mg/ml). Kinetički parametri su određeni istovremeno za sve eksperimentalne podatke korišćenjem hibridnog genetskog algoritma. Izvršena je detaljna analiza uticaja parametara procesa na koncentracije laktoze i GOS. Predloženi model je pokazao veoma dobro kvantitativno slaganje sa eksperimentalnim rezultatima, sa srednjom greškom od 9,34 %. Što je još važnije, kvalitativni trendovi promene koncentracije laktoze i proizvoda (glukoze, galaktore i GOS-a) u vremenu se odlično predviđaju, posebno ako se uzme u obzir da su koncentracije enzima i laktoze varirane u širem opsegu nego što je do sada objavljeno u literaturi. Takođe, analiza između dve uporedne reakcije, transglikozilacije i hidrolize laktoze, potvrdila je pozitivan efekat povećanja koncentracije laktoze na proizvodnju GOS. S druge strane, koncentracija enzima je odredila reakciono vreme u kome se postiže maksimalna koncentracija GOS. U ovom radu je zatim razvijen novi mehanistički kinetički model enzimski katalizovane sinteze frukto-oligosaharida (FOS), koji pripadaju grupi etabliranih prebiotika, kao i GOS. Korišćena je komercijalna mešavina enzima Pectinek® Ultra SP’L dobijena od Aspergillus aculeatus. Različite početne koncentracije enzima (1-5 zap%) i koncentracije saharoze (400–600 g/l) su korišćene u eksperimentima, a rezultati su korišćeni za određivanje kinetičkih konstanti. Ispitano je više kinetičkih modela (analogan pristup kao za GOS), a usvojen je model koji je dao srednju grešku od 13,34 % i dobro kvalitativno slaganje promena koncentracija komponenti sa vremenom. Pokazalo se, kao i kod GOS, da početna koncentracija supstrata, u ovom slučaju saharoze, značajno utiče na maksimalno postignutu koncentraciju FOS, dok je koncentracija enzima odredila vreme u kome se dostiže maksimum FOS. U trećem delu ove teze je predložen inovativni spiralni reaktor sa pregradama (SORP) i oscilatornim tokom za kontinualnu proizvodnju prebiotika. Prikazan je dizajn SORP, prototip (dužine 4 m, i prečnika 10 mm) izrađen pomoću 3D štampe, u kome su izvedeni prvo eksperimenti za ispitavanje strujanja, a zatim sa enzimskom reakcijom. Na primeru sinteze GOS sa slobodnim enzimom je pokazano da se kontinualna proizvodnja može uspešno ostvariti, uz visoku koncentraciju željenog proizvoda. Takođe je pokazano da se sa povećanjem protoka kroz SORP, mešanje intenzivira, a vreme zadržavanja skraćuje, pa se stacionarne koncentracije laktoze i proizvoda dostižu za vreme koje odgovara dvostrukoj vrednosti srednjeg vremena zadržavanja. Nezavisni eksperimenti sa obeleženom supstancom su izvedeni kako bi se kvantifikovalo mešanje u SORP. Rezultati su pokazali da je strujanje tečnosti u SORP relativno blisko klipnom, uz određena odstupanja koja zavise od protoka oscilatornog, kao i normalnog (nesocilatornog) toka. U radu je korišćen model kaskade idealno izmešanih sudova u nizu, koji dobro opisuje strujanje, uz adekvatno određen broj sudova N. Predložena je i nova bezdimenzona koreleacija koja daje vezu između broja sudova N i Rejnoldsovih brojeva ocilatornog (Reo) i normalnog toka (Ren). U eksperimentima u SORP je ispitana i mogućnost korišćenja recikla, kako bi se intenzifikovalo mešanje i obezbedila velika vremena zadržavanja, što je povoljno za spore biohemijske reakcije. Međutim, pokazano je da recikl nije neophodan, u slučaju da je dužina reaktora 4 m. U eksperimentima je analizirano i ponašanje enzima u SORP, koji se u toku reakcije ne troši. Rezultati eksperimenata su pokazali razliku unete i izlazne mase enzima, odnosno da se određena, a ne mala, količina enzima zadržava u reaktoru. Numeričkom optimizacijom su dobijeni optimalni protoci i ulazne koncentracije enzima. Korišćene su dve funkcije cilja, jedna koja daje maksimalnu proizvodnost GOS u datoj zapremini u odnosu na konverziju laktoze, i druga koja daje maksimalnu proizvodnost GOS, ali u odnosu na ulaznu koncentraciju enzima. U oba slučaja optimizacija je potvrdila da nije potrebno uvoditi recikl, kao i da treba koristiti maksimalno moguću koncentraciju laktoze. Za aktivniji enzim optimizacija je dala veliku produktivnost GOS od 17 mmol/min u kratkom vremenu zadržavanja od samo 2,4 min i uz upotrebu maksimalne koncentracije enzima. Druga funkcija cilja je dala manju produktivnost GOS od oko 9 mmol/min u dužem vremnu zadržavanja od oko 4,3 min, ali uz uštedu enzima, jer je koncentracija duplo manja, a potrošnja (protok) enzima za 73,2 % manja u odnosu na prvu funkciju cilja. U ovoj tezi je pokazano da je prelazak sa šaržnog na kontinualni način proizvodnje prebiotika pokazao bolje rezultate u vrednostima konverzije laktoze, selektivnosti i proizvodnosti. SORP se pokazao kao atraktivno rešenje za intenzifikaciju procesa proizvodnje etabliranih prebiotika.

The subject of this dissertation is the intensification of the prebiotic production process, and it has been demonstrated that batch-to-continuous prebiotic oligosaccharide enzymatic production can be achieved with a significant increase in productivity. In this thesis, a new mechanistic model for the synthesis of galacto-oligosaccharides (GOS) with β-galactosidase from Aspergillus oryzae is proposed. The experiments were performed in a laboratory batch system. Several kinetic models with different reaction mechanisms were tested, covering a wide range of initial concentrations of lactose (200–400 g/l) and enzyme (0.5-2 mg/ml). Kinetic parameters were estimated simultaneously for all experimental data using a hybrid genetic algorithm. A detailed analysis of the influence of process parameters on lactose and GOS concentrations was performed. The proposed model showed a very good quantitative agreement with the experimental data, with a mean error of 9.34 %. More importantly, the qualitative trends of change in lactose and product concentration (glucose, galactose and and GOS) over time are excellently predicted, especially considering enzyme and lactose concentrations over a wider range than previously reported in the literature. Also, the analysis between two comparative reactions, transglycosylation and lactose hydrolysis, confirmed the positive effect of increasing lactose concentration on GOS production. On the other hand, the enzyme concentration determined the reaction time at which the maximum GOS concentration was reached. Then, a new mechanistic model of enzyme-catalyzed synthesis of fructo-oligosaccharides (FOS), which belong to the group of established prebiotics as well as GOS, was also developed. A commercial Pectinek® Ultra SP'L enzyme mixture obtained from Aspergillus aculeatus was used. Different initial enzyme concentrations (1–5 vol.%) and sucrose concentrations (400–600 g/l) were used in the experiments, and the kinetic constants were determined from the results. Several kinetic models were examined (analogous approach as for GOS), and the most favorable model was adopted, which gave a mean error of 13.34 % and a good qualitative agreement of changes in component concentrations with time. Similar to GOS, it was demonstrated that the maximum FOS concentration achieved is greatly influenced by the initial concentration of the substrate—in this case, sucrose— while the enzyme concentration determines the reaction time at which the maximum FOS is reached. In the third part of this thesis, an innovative spiral reactor with baffles and oscillatory flow (SORP) is proposed for the continuous production of prebiotics. The SORP design is presented using a prototype (4 m long and 10 mm in diameter) made using 3D printing, in which experiments were performed first to test the flow, and then with the enzymatic reaction. Using the example of GOS synthesis with a free enzyme, it was shown that continuous production can be successfully achieved with a high concentration of the desired product. Additionally, it was demonstrated that the stationary concentrations of lactose and product are reached in a time corresponding to double the mean residence time when the flow rate through the SORP increases, intensifying mixing and reducing retention time. Independent tracer experiments were performed to confirm the well-quantified mixing in SORP. The results showed that flow in SORP is relatively close to plug flow, with some deviations depending on oscillatory flow as well as normal (non-oscillatory) flow. In the study, it was shown that the cascade model of ideally mixed tanks-in-series describes the flow behavior well, with an adequately determined number of tanks in series N. A new dimensionless correlation was also proposed that gives a connection between the virtual number of tanks in series N and the oscillatory Reynolds numbers (Reo) and normal flowrate (Ren). In the SORP experiments, the possibility of using recycle was examined in order to intensify the mixing and ensure long retention times, which is favorable for slow biochemical reactions. However, it was shown that recycling is not necessary if the length of the reactor is 4 m. The experiments also analyzed the behavior of the enzyme in SORP, which is not consumed during the reaction. The results of the experiments showed a difference between the input and output mass of the enzyme, indicating that a significant amount of enzyme is held in the reactor. Enzyme initial concentrations and optimal flows were obtained using numerical optimization. Two objective functions were used: one that gives the maximum GOS productivity in a given volume versus lactose conversion, and another that gives the maximum GOS productivity but versus initial enzyme concentration. In both cases, the optimization confirmed that it is not necessary to introduce recycling and that the maximum possible concentration of lactose should be used. For the more active enzyme, the optimization gave a high GOS productivity of 17 mmol/min with a short retention time of only 2.4 min and using the maximum enzyme concentration. The second objective function gave a lower productivity of GOS of about 9 mmol/min in a longer retention time of about 4.3 min, but with a saving of enzymes because the concentration is twice as low and the consumption (flow) of enzymes is 73.2 % lower compared to the first objective function. The shift from batch to continuous prebiotic production provided better lactose conversion, selectivity, and productivity values, as demonstrated in this dissertation. SORP proved to be an attractive solution for the intensification of the established prebiotic production process

prebiotici, enzimska reakcija, kinetički model, intenzifikacija procesa, optimizacija procesa, spiralni reaktor sa pregradama i oscilatornim tokom, model neidealnog strujanja

prebiotics, enzymatic reaction, kinetic model, process intensification, process optimization, spiral reactor with baffles and oscillatory flow, model of non-ideal flow

615.24:543.635.24(043.3)

Tekst