Molecular mechanisms of cytotoxic activity of ascorbic acid and menadione in human glioblastoma cell line U251

[А. Деспотовић]

123 стр.

Биологија - Биологија малигне ћелије / Biology - Cancer cell biology

Глиобластоми су најагресивнији и најучесталији тумори мозга у адултној популацији. Карактерише их висока инвазивност и резистенција на терапију. У овој докторској дисертацији је проучаван цитотоксични ефекат редокс-активног пара аскорбинске киселине (АК) и менадиона (МД) на ћелијама хуманог глиобластома U251. Могућност појачавања њиховог цитотоксичног потенцијала испитана је модулацијом аутофагије, процеса са важном улогом у одговору глиобластома на конвенционалну терапију, као и применом малих молекулских инхибитора AKT (10-DEBC) и JNK (SP600125), киназа које припадају најчешће измењеним сигналним путевима у глиобластомима. У комбинацији, АК и МД синергистички изазивају некрозу посредовану деполаризацијом мембране митохондрија и оксидативним стресом, док примењени појединачно нису токсични за U251 ћелије. Комбинација АК+МД и, у мањој мери, сâм МД покрећу аутофагију у U251 ћелијама, што је показано појавом аутофагних вакуола, појачаном разградњом аутофагног супстрата p62 и повећањем нивоа маркера аутофагије у U251 ћелијама ̶ протеина LC3-II и беклин-1. Оба третмана повећавају фосфорилацију AMPK, позитивног регулатора аутофагије, али само АК+МД повећава експресију већине гена повезаних са аутофагијом и утиче на активност нисходних супстрата AMPK, односно инхибира mTOR/S6K и активира ULK1. Фармаколошка и генетичка инхибиција аутофагије смањују токсичност АК+МД, док позитивна регулација аутофагије повећава токсичност и АК+МД и МД. Комбинација АК+МД активира JNK и, након пролазне активације, снажно инхибира AKT киназу. Мали молекулски инхибитори AKT и JNK киназа, 10-DEBC и SP600125, редом, повећавају осетљивост U251 ћелија на МД и потенцирају некрозу изазвану комбинацијом АК и МД. Ефекат 10-DEBC корелира са појачавањем оксидативног стреса и цитотоксичне аутофагије у третману МД и АК+МД и поништен је генетичком инхибицијом аутофагије. Једињење SP600125 повећава осетљивост U251 ћелија на МД и АК+МД такође потенцирањем оксидативног стреса, али независно од процеса аутофагије. Антиоксиданс N-ацетил цистеин спречава активацију аутофагије, као и промене у активностима AMPK/mTOR/ULK1, AKT и JNK киназа и смрт U251 ћелија. Ниједан од испитиваних третмана није токсичан за здраве ћелије хуманих фибробласта MRC5. Добијени резултати указују да се МД и АК+МД у комбинацији са активаторима аутофагије или инхибиторима AKT и JNK киназа могу даље испитивати као нова стратегија за лечење глиобластома. Такође, показани молекуларни механизми представљају добру основу за развој терапијских стратегија за превазилажење резистенције глиобластома на конвенционалне хемиотерапеутике.

population, characterized by high invasiveness and resistance to therapy. In this doctoral dissertation, the cytotoxic effect of the redox-active pair of ascorbic acid (AA) and menadione (MD) on human glioblastoma U251 cells was investigated. The possibility of enhancing their cytotoxic potential was investigated through the modulation of autophagy, a process that plays an important role in the response of glioblastomas to conventional therapy, as well as through the application of small molecule inhibitors of AKT (10-DEBC) and JNK (SP600125), kinases involved in the most frequently altered signaling pathways in glioblastomas. AA and MD in combination synergistically induce necrosis mediated by mitochondrial membrane depolarization and oxidative stress, whereas neither agent is cytotoxic to U251 cells when applied individually. The combination of AА+MD, and to a lesser extent MD alone, trigger autophagy in U251 cells, as evidenced by the appearance of autophagic vacuoles, enhanced degradation of the autophagic substrate p62, and increased levels of autophagy markers in U251 cells ̶ proteins LC3-II and Beclin-1. Both treatments increase the phosphorylation of positive autophagy regulator AMPK, but only AA+MD increases the expression of most autophagy related genes and affects the activity of downstream substrates of AMPK: inhibits mTOR/S6K and activates ULK1. Pharmacological and genetic inhibition of autophagy decrease the toxicity of AA+MD, whereas upregulation of autophagy increases the toxicity of both AA+MD and MD. The combination of AA and MD activates JNK and, following transient activation, robustly inhibits AKT kinase. The small molecule inhibitors of AKT and JNK kinases, 10-DEBC and SP600125, respectively, increase the sensitivity of U251 cells to MD and potentiate the necrosis induced by the combination of AA and MD. The effect of 10-DEBC correlates with enhancement of oxidative stress and cytotoxic autophagy in MD- and AA+MD-treated cells and is reversed by genetic inhibition of autophagy. The compound SP600125 also increases the sensitivity of U251 cells to MD and AA+MD by potentiating oxidative stress, but independently of the autophagy process. The antioxidant N-acetyl cysteine prevents the activation of autophagy, as well as changes in AMPK/mTOR/ULK1, AKT and JNK kinase activities and U251 cell death. None of the treatments tested exhibit toxicity towards healthy human MRC5 fibroblast cells. The obtained results suggest that MD and AA+MD in combination with autophagy activators or AKT and JNK kinase inhibitors can be further investigated as a new strategy for the treatment of glioblastoma. Also, the molecular mechanisms identified provide a good basis for the development of therapeutic strategies to overcome the resistance of glioblastoma to conventional chemotherapeutic agents.

менадион, аскорбинска киселина, глиобластом, оксидативни стрес, аутофагија, AKT киназа, JNK киназа, 10-DEBC хидрохлорид, SP600125

menadione, ascorbic acid, glioblastoma, oxidative stress, autophagy, AKT kinase, JNK kinase, 10-DEBC hydrochloride, SP600125

577.2:567.385.5(043.3)

Tekst