Title
Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena celobioza-dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium za povećanje enzimske aktivnosti
Creator
Blažić, Marija, 1987-
CONOR:
111152393
Copyright date
2019
Object Links
Select license
Autorstvo-Nekomercijalno 3.0 Srbija (CC BY-NC 3.0)
License description
Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način odredjen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. Osnovni opis Licence: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/rs/deed.sr_LATN Sadržaj ugovora u celini: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/rs/legalcode.sr-Latn
Language
Serbian
Cobiss-ID
Theses Type
Doktorska disertacija
description
Datum odbrane: 05.06.2019.
Other responsibilities
Academic Expertise
Prirodno-matematičke nauke
Academic Title
-
University
Univerzitet u Beogradu
Faculty
Hemijski fakultet
Alternative title
Protein engineering and development of high-throughput screening methods for Phanerochaete chrysosporium cellobiose-dehydrogenase gene library toward higher enzime activity
Publisher
[M. Blažić]
Format
146 listova
description
Hemija - Biohemija / Chemistry
- Biochemistry
Abstract (sr)
Celobioza-dehidrogenaza (CDH) je ekstracelularni enzim proizveden od strane mnogih gljiva bele truleži, uključujući i dobro proučen P. chrysosporium. Enzim oksiduje širok spektar elektron akceptora kao što su krajevi celobioze i celo-oligosaharida, produkata celulozne biorazgradnje, do njihovih odgovarajućih 1,5-laktona, koji se potom spontano hidrolizuju do karboksilnih kiselina u vodenim rastvorima. Smatra se da zajedno sa celulazama i lignin peroksidazama CDH igra važnu ulogu u biološkoj razgradnji nerastvorne celuloze od strane gljiva bele truleži. CDH takođe može da osim na solubilne elektron akceptore prenese elektrone i na elektrodu i da se iskoristi za pravljenje amperometrijskih biosenzora za merenje koncentracije celobioze i naročito detekciju laktoze u hrani. Da bi se poboljšala upotrebljivost CDH za razgradnju celuloze, proizvodnju celobionske i laktobionske kiseline kao i za merenje koncentracije disaharida neophodno je povećati njenu aktivnost i eventualno stabilnost. Da bi to postigli mi smo koristili metode proteinskog inženjeringa i visoko efikasne pretrage biokatalizatora. Proteinski inženjering podrazumeva promenu nukleotidne sekvence gena koji kodira određeni protein u cilju promene njegove aktivnosti i stabilnosti.
Kloniranje gena celobioza-dehidrogenaze iz P. chrysosporium u Saccharomyces cerevisiae InvSC1 je omogućilo korišćenje dirigovane evolucije na našem sistemu. Nasumičnom mutagenezom su dobijeni i nađeni mutanti sa povišenom aktivnošću. Strukturne analize su pokazale da mutacije utiču na aktivnost bilo da se nalaze u blizini aktivnog mesta, bilo preko udaljenih interakcija. Najbolji mutant je pokazao 2,2 puta povećanu kcat za laktozu i celobiozu kao supstrate...
Abstract (en)
Celobioza dehydrogenase (CDH) is an extracellular enzyme produced by many white-rot fungi, including a well-studied Phanerochaete chrysosporium. The enzyme oxidizes a wide range of electron acceptors such as reducing ends of celobiose, cello-oligosaccharides, and cellulose biodegradation products, to their corresponding 1,5-lactones, which are then in an aqueous solutions spontaneously hydrolysed to carboxylic acids. It is believed that together with cellulases and lignin peroxidases, CDH plays an important role in biodegradation of insoluble cellulose by the white-rot mushroom. CDH can transfer electrons to the soluble electron acceptors and also directly to the electrodes and therefore can be used in amperometric biosensors for measuring concentrations of cellobiose and for detection of lactose in food. In order to improve the usability of CDH for cellulose degradation, production of celobionic and lactobionic acid, as well as measurement of the concentration of disaccharides, it is necessary to increase CDH activity and eventually stability. To achieve this, we used methods of protein engineering and high throughput screening of biocatalysts. Protein engineering implies the change in a nucleotide sequence of the gene encoding the protein in order to change its activity and stability.
Cloning of cellobiose-dehydrogenase gene from P. chrysosporium into Saccharomyces cerevisiae InvSC1 has enabled the use of a directed evolution on our system. Mutants with increased activity were obtained by random mutagenesis and screening. Structural analyzes showed that mutations can affect the activity whether they are close to the active site or from distant interactions. The best mutant showed a 2.2-fold increase in kcat for lactose and cellobiose as substrates...
Authors Key words
celobioza-dehidrogenaza, dirigovana evolucija, resazurin, fluorescentni esej, prikazivanje na površini ćelija kvasca, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
Authors Key words
cellobiose dehydrogenase, directed evolution, resazurin, fluorescent assay, yeast surface display, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
Classification
547.9:577.152.1(043.3)
Type
Tekst
Abstract (sr)
Celobioza-dehidrogenaza (CDH) je ekstracelularni enzim proizveden od strane mnogih gljiva bele truleži, uključujući i dobro proučen P. chrysosporium. Enzim oksiduje širok spektar elektron akceptora kao što su krajevi celobioze i celo-oligosaharida, produkata celulozne biorazgradnje, do njihovih odgovarajućih 1,5-laktona, koji se potom spontano hidrolizuju do karboksilnih kiselina u vodenim rastvorima. Smatra se da zajedno sa celulazama i lignin peroksidazama CDH igra važnu ulogu u biološkoj razgradnji nerastvorne celuloze od strane gljiva bele truleži. CDH takođe može da osim na solubilne elektron akceptore prenese elektrone i na elektrodu i da se iskoristi za pravljenje amperometrijskih biosenzora za merenje koncentracije celobioze i naročito detekciju laktoze u hrani. Da bi se poboljšala upotrebljivost CDH za razgradnju celuloze, proizvodnju celobionske i laktobionske kiseline kao i za merenje koncentracije disaharida neophodno je povećati njenu aktivnost i eventualno stabilnost. Da bi to postigli mi smo koristili metode proteinskog inženjeringa i visoko efikasne pretrage biokatalizatora. Proteinski inženjering podrazumeva promenu nukleotidne sekvence gena koji kodira određeni protein u cilju promene njegove aktivnosti i stabilnosti.
Kloniranje gena celobioza-dehidrogenaze iz P. chrysosporium u Saccharomyces cerevisiae InvSC1 je omogućilo korišćenje dirigovane evolucije na našem sistemu. Nasumičnom mutagenezom su dobijeni i nađeni mutanti sa povišenom aktivnošću. Strukturne analize su pokazale da mutacije utiču na aktivnost bilo da se nalaze u blizini aktivnog mesta, bilo preko udaljenih interakcija. Najbolji mutant je pokazao 2,2 puta povećanu kcat za laktozu i celobiozu kao supstrate...
“Data exchange” service offers individual users metadata transfer in several different formats. Citation formats are offered for transfers in texts as for the transfer into internet pages. Citation formats include permanent links that guarantee access to cited sources. For use are commonly structured metadata schemes : Dublin Core xml and ETUB-MS xml, local adaptation of international ETD-MS scheme intended for use in academic documents.