Regulation of expression of kgmB gene from Streptomyces tenebrarius

[S. Vojnović]

182, [4] lista

Molekularna biologija / Molecular biology

Bakterija Streptomyces tenebrarius, proizvođač nebramicinskog kompleksa aminoglikozidnih antibiotika, štiti se od sopstvenih toksičnih proizvoda i pomoću modifikacije ribozoma. Metilacijom specifičnih nukleozida u okviru 16S rRNK, čime je onemogućeno vezivanje aminoglikozida za njegov target, tj. 30S ribozomalnu subjedinicu, postiže se visok nivo rezistencije. Za ovaj fenomen su odgovome S-adenozil-L-metionin (SAM) zavisne 16S rRNK metiltransferaze (MTaze) kakva je i KgmB MTaza iz bakterije S. tenebrarius. Smatra se da za postizanje potpune zaštite nije neophodna maksimalna ekspresija gena, tj. da je svega nekoliko molekula funkcionalnog enzima potrebno da se modifikuju sve 30S ribozomalne subjedinice. Zbog toga je postojanje mehanizama negativne autoregulacije ekspresije, kao načina da se koncentracija enzima održi na konstantnom i vrlo niskom nivou, sasvim očekivano. Model translacione autoregulacije kgmB gena, zasnovan na in vivo i in silico analizama, pretpostavlja da KgmB MTaza prepoznaje isti motiv (ili više motiva) unutar 16S rRNK, koji je prisutan i u okviru 5’UTR regiona na kgmB iRNK. Po ovom modelu bi se KgmB MTaza, nakon što izvrši modifikaciju svog primamog targeta (16S rRNK), vezivala za sekundami target, sopstvenu iRNK, onemogućavala inicijaciju translacije i tako sprečavala sopstvenu ekspresiju. U ovom radu je testirana hipoteza o mehanizmu regulacije ekspresije kgmB gena, primenom različitih in vitro i in vivo tehnika. Eksperimenti usporene elektroforetske pokretljivosti su pokazali da se KgmB MTaza sa podjednakom efikasnošću, tj. malim afinitetom, vezuje za sve analizirane RNK. Na osnovu rezultata ,,footprint“ eksperimenata nije bilo moguće precizno definisati mesto vezivanja KgmB MTaze unutar 5’UTR regiona na kgmB iRNK. Rezultati ,,toeprint“ eksperimenata nisu omogućili da se pouzdano odredi mesto vezivanja ribozoma za 5’UTR region na kgmB iRNK, kao ni da se definiše precizan mehanizam regulacije kgmB gena. Postoji značajna homologija između KgmB MTaze i Sgm MTaze iz bakterije Micromonospora zionensis, na struktumom i funkcionalnom nivou. Zbog toga je in vitro mapiranjem pomoću različitih RNaza analizirano postojanje sekundamih stmktura na kgmB i sgm iRNK. Pokazano je da specifična sekundama stmktura, najpre određena in silico, u okvim 5’UTR regiona na sgm iRNK postoji, dok kod 5’UTR regiona na kgmB iRNK rezultati ovog eksperimenta nisu potvrdili in silico predikciju. Translaciona autoregulacija kgmB i sgm gena je testirana u komercijalnom „cell- free“ sistemu za in vitro transkripciju i translaciju gde je pokazano da obe MTaze reprimiraju sintezu odgovarajućeg fuzionog proteina. Na osnovu rezultata svih opisanih eksperimenata se može zaključiti da KgmB i Sgm MTaza pokazuju sposobnost autoregulacije, ali i da je mehanizam odgovoran za ovaj fenomen mnogo kompleksniji od ranije predloženog.

Streptomyces tenebrarius, the producer of nebramicin complex of aminoglycoside antibiotics, utilizes methylation of ribosomes as a mean of self-protection. Through methylation of specific nucleosides within the tRNA acceptor aminoacyl site of 16S rRNA, which impedes binding of aminoglycosides to the 30S ribosomal subunit, S-adenosyl-L- methionine-dependant 16S rRNA methyltransferases (MTase), such as KgmB MTase from S. ienebrarius confer a high-level resistance to aminoglycosides. The level of antibiotic resistance is not usually related to MTase gene dosage and expression of relatively few enzyme molecules is sufficient for complete modification of the target. A negative autoregulatory system may be involved in maintaining both constant and low concentrations of this protein. The model for translational autoregulation of KgmB MTase, based on in vivo studies and in silico prediction, suggests that KgmB MTase recognizes the same sequences and/or structure within 16S rRNA and 82 nucleotides long 5’ untranslated region (5’ UTR) on its own mRNA, and that is capable of preventing further translation if interacts with these sequences. Our aim was to further elucidate the mechanism of translational autoregulation of KgmB MTase, using different in vitro and in vivo techniques. Electromobility shift assays revealed that KgmB MTase binds to all tested RNAs, with low affinity. RNA footprinting studies failed to indicate the exact position of KgmB binding to the kgmB 5’UTR. Toeprinting results were not clear enough to provide the evidence, beyond reasonable doubt, for KgmB interference with ribosomal binding. As Sgm MTase from Micromonospora zionensis exhibits similar mechanism of autoregulation both the kgmB and sgm mRNA secondary structures were studied in vitro by enzymatic probing with different RNases. The analysis revealed disagreement with computer prediction for the kgmB 5’UTR, but supported computer prediction for the sgm 5’UTR. Results from cell-free translation experiments demonstrated that KgmB and Sgm MTase inhibit expression of kgmB-lacZ and sgm-lacZ gene fusions, respectfully. These findings confirm that KgmB and Sgm MTase do autoregulate themselves, but also indicate that mechanism for their translational autoregulation is more complex than it was previously proposed.

aminoglikozidi; rezistencija; metiltransferaze; regulacija

Aminoglycosides; Resistance; Methyltransferases; Regulation

579.61(043.3)

Tekst