Interaction of ultrashort laser pulses with hemoglobin molecule and application of advanced nonlinear microscopy in imaging of erythrocytes

[М. Радмиловић]

90 стр.

Биофизика - Биофотоника / Biophysics - Biophotonics

Ова докторска дисертација испитује интеракцију ултракратких ласерских импулса са молекулима хемоглобина који се налазе унутар еритроцита, као и са молекулима хемоглобина ван еритроцита, са аспекта генерисања флуоресцентног фотопродукта. Након оптимизације протокола за генерисање фотопродукта, извршена је његова фотофизичка карактеризација применом TPEF и SPEF микроскопије, UV/VIS апсорпционе спектроскопије и TPEF емисионе спектроскопије. Добијени резултати указују на то да се приликом интеракције хемоглобина с ултракратким ласерским импулсима формира флуоресцентни фотопродукт уз фотодеградацију хемоглобина. Показано је за формирање фотопродукта потребан порфирин, али не и Fe2+ јон, и да оксидација тј. третирање хемоглобина H2O2 доводи до формирања флуоресцентних молекулских врста. Установљено је да је могуће извршити просторно локализовано формирање фотопродукта ласерском скенирајућом микроскопијом на танком филму хемоглобина. Флуоресцентни фотопродукт је показао високу фотостабилност и искоришћен је и за селективно ласерско обележавање еритроцита у пуној крви, чиме је омогућено одређивање просторне расподеле хемоглобина. In vitro индуковани оксидативни стрес код еритроцита довео је до јасних промена у параметрима расејане светлости и флуоресценције у анализи проточном цитометријом, као и деформабилности у анализи ектацитометријом. Интегрисани оптички приступ иницијално је валидиран на еритроцитама пацијената са дијабетесом. Резултати ове докторске дисертације, чија је окосница добијање флуоресцентног фотопродукта хемоглобина, доприносе унапређењу техника нелинеарне ласерске микроскопије у анализи еритроцита, уједно пружајући нове могућности за интегрисану дијагностику засновану на оптичким методама без коришћења обележивача код различитих патофизиолошких стања еритроцита.

This doctoral dissertation examines the interaction of ultrafast laser pulses with hemoglobin molecules inside erythrocytes and with hemoglobin molecules outside erythrocytes from the perspective of generating fluorescent photoproducts. After optimizing the protocol for generating photoproducts, their photophysical characterization was performed using TPEF and SPEF microscopy, UV/VIS absorption spectroscopy, and TPEF emission spectroscopy. The results indicate that when hemoglobin interacts with ultrafast laser pulses, a fluorescent photoproduct is formed alongside the photodegradation of hemoglobin. It was shown that the photoproduct formation requires porphyrin but not Fe2+ ion and that oxidation, or treatment of hemoglobin with H2O2, leads to the formation of fluorescent molecular species. It was established that spatially localized formation of photoproducts is possible using laser scanning microscopy on a thin film of hemoglobin. The fluorescent photoproduct demonstrated high photostability and was also used for selective laser labeling of erythrocytes in whole blood, which allowed for determining the spatial distribution of hemoglobin. In vitro induced oxidative stress in erythrocytes led to clear changes in light scattering and fluorescence parameters in flow cytometry analysis, as well as deformability in ektacytometry analysis. The integrated optical approach was initially validated on erythrocytes from diabetic patients. The results of this doctoral dissertation, centered around obtaining fluorescent hemoglobin photoproducts, contribute to advancing nonlinear laser microscopy techniques in erythrocyte analysis while also providing new possibilities for integrated diagnostics based on optical methods for various pathophysiological states of erythrocytes.

хемоглобин, еритроцити, фотопродукт, двофотонска ласерска скенирајућа микроскопија, проточна цитометрија, деформабилност, ектацитометрија

hemoglobin, erythrocytes, photoproduct, two-photon laser scanning microscopy; flow cytometry, elongation index, deformability, ektacytometry

577.345:543.42(043.3)

Tekst